原核表達(dá)操作步驟及注意事項

將克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達(dá)。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應(yīng)用。大腸桿菌用于表達(dá)重組蛋白有以下特點：

易于生長和控制；用于細(xì)菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)?？晒┻x擇。但是，在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。

表達(dá)載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達(dá)載體通常為質(zhì)粒，典型的表達(dá)載體應(yīng)具有以下幾種元件：

（1）選擇標(biāo)志的編碼序列；

（2）可控轉(zhuǎn)錄的啟動子；

（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子，核糖體結(jié)合位點)；

（4）一個多限制酶切位點接頭；

（5）宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列。

原核表達(dá)一般程序如下：

獲得目的基因－準(zhǔn)備表達(dá)載體－將目的基因插入表達(dá)載體中（測序驗證）－轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌－誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)－表達(dá)蛋白的分析－擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測

一、試劑準(zhǔn)備

1、LB培養(yǎng)基。

2、100mM IPTG（異丙基硫代-β-D^-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH₂O中，0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存。

二、操作步驟

（一）獲得目的基因

1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第yi鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

（二）構(gòu)建重組表達(dá)載體

1、載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

（三）獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。

2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

（四）誘導(dǎo)表達(dá)

1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀ ≌0.4-1.0（OD600 0.6，大約需3hr）。

3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實驗組，兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml，離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混勻，70℃10min。

5、離心12000g×1min，取上清作為樣品，可做SDS-PAGE等分析。

三、注意事項

1、選擇表達(dá)載體時，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的終應(yīng)用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達(dá)；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達(dá)。

2、融合表達(dá)時在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)時，對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。