ELISA操作常見問題

 

ELISA方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術要求，在檢測過程中除正常反應外，有時常見到一些錯誤的結果。引起ELISA測定錯誤結果的原因主要有：①標本因素；②試劑因素；③操作因素。下面就一些常見ELISA操作過程中的問題一一分析。

 

1．樣品稀釋 

酶聯免疫反應是一種敏感性很高的反應，如果血清不稀釋，不可避免會產生很強的非特異性反應，出現假陽性。因此，國外檢測血清抗體的試劑盒，均規定將血清稀釋至適當的倍數，以降低非特異性反應，使特異性的抗原抗體反應充分體現出來。一般產品的樣品稀釋倍數均通過大量試驗確定，以保證試驗的靈敏度和特異性。但是，有些用戶未能嚴格按使用說明書操作，如某些產品應取10μl樣品進行稀釋，個別用戶取5μl甚至1μl樣品進行稀釋，由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠，因此造成樣品稀釋倍數不準確，檢測結果出現問題。

 

2．試劑盒平衡 

試劑盒中所有試劑和板條均應在試驗前平衡至室溫(約25℃)，一般需在室溫放置20～30分鐘以上。平衡時間太短會造成試劑混勻不夠，樣品孵育時間相對縮短，ELISA反應不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。

 

3．樣品和試劑的混勻 

稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗的均一性。

 

4．加樣 

在現在的ELISA商品試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。

 

5．溫育 

溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原全部結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。一些操作者，擅自改變說明書操作，使用自己喜歡的溫育時間和溫育溫度，這樣造成一些不必要的麻煩。因為，不同試劑盒有不同的溫育時間和溫育溫度的選擇，隨意更改溫育時間或者溫育溫度將導致試驗結果出現偏差。

 

6．洗板 

固相免疫測定技術是一種非均相免疫測定技術，需以洗滌操作將特異結合于固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。洗板對于ELISA測定來說，也是極其關鍵的一步。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及時更換吸水紙，尤其是拍過酶標記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗結果。

 

7．邊緣效應 

使用96孔板的ELISA測定中，常發現有“邊緣效應"，即外周孔顯色較中心孔深。經研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應"，并且可提高測定的重復性。

 

8．顯色 

顯色一定要控制時間,根據試劑盒說明操作即可。一般來說，顯色時間過短，結果偏低；顯色時間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。

 

9．比色 

比色要注意波長的選擇。以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據要求隨時更換。因此，容易出現濾光片錯用的問題。 

其次，單波長或雙波長比色選擇的問題。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標儀給出的數值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優點。由于ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色。 

 

綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結果的因素卻較多，分布在測定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測定中出現問題的可能原因，特對常見問題及原因歸納總結于下表。

 

操作過程中可能出現的問題和解決方法

 

問題 可能原因 解決方法

顯色淡，靈敏度偏低 1、試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高 盡量縮短運輸時間，夏季應放冰塊降溫

2、試劑盒未充分平衡 試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。

3、培養箱溫度不足37℃ 注意培養箱溫度，放入反應板后盡量減少開啟次數以免影響溫度恒定，非隔水式培養箱尤其應注意

4、保溫時間不足 校正定時鐘準確定時

5、洗滌時沖擊力太大、浸泡時間過長、洗滌次數增加 按說明書要求保留洗滌時間，準確記住洗滌次數

6、移液器吸液量不足，吸嘴內壁掛水太多或內壁不清潔 校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密，吸嘴內壁要清潔，最好一次性使用

7、蒸餾水水質有問題 使用新鮮合格的蒸餾水

8、底物作用時間不足 準確定時

背景深，全部呈有色, 1、洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標記物殘留 濃縮洗液準確配制；10倍濃縮洗滌液如有結晶則應讓結晶于室溫全部溶解后再量取稀釋；充分洗滌，全部拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用，不要反復使用，否則易造成污染

2、樣品污染 樣品應新鮮采集，或低溫保存，防止污染

3、培養箱溫度超過37℃或反應時間過長 調整培養箱溫度，準確定時

4、吸嘴重復使用，未洗凈或消毒不干凈 吸嘴盡可能一次性使用

5、蒸餾水被污染 使用新鮮蒸餾水

6、酶等試劑混用 不同批號試劑勿混用

7、一次實驗的標本量過多，加樣時間太長，導致實際反應時間延長 合理安排實驗，避免幾塊酶標板同時加樣

重復性不佳 1、樣品數量多少不一，加樣時間有長有短 重復某一樣品時，加樣時間盡可能與第一次接近

2、保溫時間不一致，洗滌條件不一致，操作人員不一致 重復測定標本，操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性

3、加樣量不一致 樣品稀釋前應充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴

出現白板，陽性對照不顯色 顯色液變質 更換新的顯色液

洗滌液配制有誤 請按說明書所示稀釋倍數配制

未加酶結合物而認為已加入 注意不要漏加

終止液誤作洗滌液稀釋或當底物液使用 每次加液前均應看清標簽