細胞培養(yǎng)如何應對支原體污染

細胞培養(yǎng)物被支原體污染是極普遍的問題，面對支原體污染給細胞培養(yǎng)帶來的巨大難題，世界各國開始重視，并相繼建立了細胞庫，對細胞質(zhì)量進展控制，效果很好，支原體污染的問題得以限制。目前已知能污染細胞的支原體有20多種以上，其中95％以上的支原體污染是口腔支原體。

目前已知的主要污染源是動物血清、胰酶和已污染培養(yǎng)物的氣溶膠，例如，豬鼻支原體通過胰酶，在消化細胞時進入細胞培養(yǎng)物，并造成污染。在原代細胞與傳代細胞的檢測中，原代細胞與傳代細胞分離出支原體的頻率是有明顯差異的，傳代次數(shù)越多的細胞，污染支原體的可能性就越大，這也是多次與動物血清、胰酶和已污染培養(yǎng)物的氣溶膠接觸后造成的，在原代細胞中，污染率低于4%，而傳代細胞的污染率則高達57%~92%。

支原體的介紹

支原體是目前已知一類能在無生命培養(yǎng)基上生長繁殖的最小的原核細胞微生物，分為兩個屬：一為支原體屬（Mycoplasma），有幾十個種；另一為脲原體屬（Ureaplasma），僅有一種。革蘭染色 為陰性，但不易著色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。                                                           

支原體在自然界分布廣泛，無細胞壁，直徑為0.1-0.3μm，且形態(tài)易變，極易通過除菌過濾器。大部分支原體繁殖速度比細菌慢，適宜生長溫度為35℃，適合于偏堿條件下生存（pH7.6—8.0），

對酸耐受性差，對75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。對熱比較敏感在細胞培養(yǎng)過程中如果在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)破碎 的細胞很多，需要頻繁換液才能維持傳代培養(yǎng)的時候，即應懷疑支原體污染。細胞培養(yǎng)過程中遇到的支原體95%都來自于以下四種支原體：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾支   原體， 其中萊氏無膽甾支原體為牛源性。                                                                                 

支原體的污染來源

（1）細胞之間交叉污染；                                                         

（2）細胞培養(yǎng)操作人員的口腔、皮膚等；                                       

（3）工作環(huán)境或實驗器材的污染；                                               

（4）培養(yǎng)基的污染。                                                      

支原體污染示例圖

支原體污染的嚴重性

（1）細胞外形可以沒有明顯的變化，支原體可以與細胞共存，污染后細胞液不會死亡，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁；                                                                 

（2）使用被支原體污染的細胞做實驗會嚴重影響實驗的結果，因為支原體會抑制細胞生長；導致染色   體畸變；細胞膜抗原性改變；細胞復蘇后存活率降低等。     

（3）影響細胞的代謝和功能：培液中的精氨酸被支原體大量消耗，引起細胞蛋白質(zhì)、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙；支原體活動使培液成分發(fā)生改變（如發(fā)酵型支原體降解糖類產(chǎn)生酸性物質(zhì)），影響細胞代謝。

（4）培養(yǎng)過程中細胞破碎較多，培養(yǎng)基pH變化明顯，需要頻繁更換新鮮培養(yǎng)基；       

（5）細胞被支原體污染后會形成共生體系導致污染不斷擴大。               

支原體污染的檢測及鑒定方法：

01

分離培養(yǎng)法

支原體的病原學檢測主要是從被污染的細胞、雞胚中分離培養(yǎng)出支原體來確定，分離培養(yǎng)法是檢測支原體污染中最為可靠準確的方法。但是支原體對環(huán)境的影響敏感，容易被滅活，而且分離培養(yǎng)操作相對繁瑣，所需時間較長，因此只能夠對支原體污染進行定性觀察。分離培養(yǎng)法在常規(guī)的支原體檢測中多用于輔助其它檢測方法。                                                                                                     

02

DNA熒光染色法

DNA熒光染色法較分離培養(yǎng)法縮短了檢測周期，主要用于細胞培養(yǎng)中污染支原體的檢測。DNA熒光染色法正是利用熒光染色劑雙苯咪唑（Bisbenzimidzole）Hoechst33258能夠結合支原體DNA中的A-T堿基富集區(qū)域的原理，被支原體污染的細胞經(jīng)染色后，其細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光點，即是富含A-T堿基區(qū)域的支原體DNA。                                                                   

03

PCR技術

PCR作為一種快速、靈敏、特異且簡便的基因診斷技術已應用于科學研究和疾病的診斷。根據(jù)支原體基因組內(nèi)的保守序列設計特異引物，對待檢樣品的核酸進行擴增，通過對擴增產(chǎn)物的大小分析作出診斷。PCR檢測技術用于支原體污染的檢測，周期短、靈敏度高、特異性好、操作簡單且一次可檢測大量樣品。                                                                                                                               

04

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA用于支原體污染的檢測中，有著良好的特異性和敏感性，一次可以完成大量樣品的檢測。如今已有LONZA等公司開發(fā)了針對細胞中污染支原體的檢測試劑盒，具有簡便、快速與定量定性檢測等特點。                                                                                                                                 

05

電鏡

一般在細胞培養(yǎng)48～72小時，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行固定、包埋、切片后才能進行觀察。                                                                                                 

06

定期檢測

支原體感染會使培養(yǎng)細胞慢慢枯萎，因此對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應該進行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規(guī)化堅持下去，是細胞培養(yǎng)實驗室應對支原體感染的關鍵。                                                                                                                     

細胞污染支原體的預防

細胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預防支原體的污染：                                           

1）控制環(huán)境污染                                                           

2）嚴格實驗操作                                                                   

3）細胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌                                                    

4）在細胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素                                               

　　支原體污染細胞后，有必要清除支原體，常用方法有：                         

1）對于非重要的細胞，如培養(yǎng)中的細胞、WCB的細胞等，將培養(yǎng)物與用過的培養(yǎng)基滅活后丟棄即可。對于較為重要的細胞，如來源珍貴或實驗室中細胞保藏量較小等可以采用以下（2）-（8）的方法。                                                             

2）用MRA處理：用支原體清除劑（Mycoplasma Removal Agent）處理細胞，作用濃度為  25μg/ml，兩周可以清除支原體。                             

3）用清洗純化法清除支原體污染的方法：細胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌，其原理是利用離心力、細胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發(fā)酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至很少. 如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。                                         

4）藥物輔助加溫處理：先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。                                           

5）使用支原體特異性血清：用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉為陰性，并且5個月后仍為陰性。                     

6）動物體內(nèi)接種除菌法：把受支原體污染的腫瘤細胞接種在同種動物皮下或腹腔中，借動物免疫系統(tǒng)消滅支原體，而腫瘤細胞卻能在體內(nèi)繼續(xù)生長，待一定時間后，從體內(nèi)取出細胞再進行培養(yǎng)繁殖。     

7）巨噬細胞吞噬法：從動物腹腔采取巨噬細胞，為排除其它細胞成分，可先進行純化，然后再加入被支原體污染的細胞培養(yǎng)液中混合培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，為檢查支原體是否已被消除干凈，可利用支持物培養(yǎng)法驗證，取出支持物逐日染色、鏡檢觀察，至支原體已被消除干凈為止。                                 

8）使用支原體清除培養(yǎng)基，每2~3天更換1次新鮮培養(yǎng)液，換液時用無菌的平衡鹽溶液洗滌細胞1~2次；期間如果細胞密度過大，請保持細胞密度適當（貼壁細胞可能需要用胰酶消化），并更換新的培養(yǎng)器皿，3天之后，即可見明顯清除效果；處理15天后，可以用支原體檢測試劑盒進行檢測，檢測支原體是否殺滅全部；如果仍有支原體殘留，可以考慮再處理6天；為避免細胞再次受到“支原體"的污染，以后每隔1個月進行支原體的常規(guī)檢測，以保證沒有新的支原體污染。                                           

注：支原體污染時細胞表現(xiàn)為長得不好，也不死亡，同時，培養(yǎng)基又是清亮的，時間長達一周也沒有什么變化，這時基本上可以判斷出是支原體污染了。