如何使用聚乙二醇獲得高質量純化質粒

都知道大量提取的質粒DNA一般需進一步純化，常用柱層析法和氯化銫梯度離心法。常使用的所有純化方法都利用了質粒DNA 相對較小及共價閉合環狀這樣兩個性質。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環DNA分子的結合量有所不同。但是此類方法也存在了一些例如使用化學物質誘導質粒突變的弊端，所以新的純化方式的摸索很有必要的。

其中很好的方法，也應是聚乙二醇分級沉淀法。首先我們了解一下什么是聚乙二醇(PEG)，聚乙二醇是一種高分子聚合物，化學式是HO(CH2CH2O)nH，無刺激性，味微苦，具有良好的水溶性，并與許多有機物組分有良好的相溶性。

PEG為一種非離子多聚物，多離子多聚物是六十年代發展起來的一類重要沉淀劑。基于多聚物的沉淀作用主要依賴于多聚物的濃度和被沉淀物的分子量大小，Laurent等(1967)提出PEG的沉淀機理主要是通過空間位置排斥，使液體中的微粒(包括生物大分子、病毒和細菌等)被迫集聚在—起而引起沉淀的發生。PEG最早應用于提純免疫球蛋白(IgG)和沉淀一些細菌病毒，后來逐漸應用于核酸和酶的分離純化，特別是用PEG分離質粒DNA，已相當普遍。

那么如何利用PEG進行質粒純化呢？

下面介紹一下PEG純化質粒的一般操作步驟：

1   向質粒溶液中加入等體積的用無菌的1.6M NaCl配置的13% w/v PEG 8000；

2   將試管內的物質渦旋充分混勻，然后-20°C孵育1 h至過夜

3   最高轉速 4°C離心30 min；

4   輕柔吸取去上清，收集沉淀；

5   用500 μl 70% 乙醇沖洗顆粒，并短暫渦旋；

6   最高轉速 25°C離心5 min，去除70% 乙醇；

7   再次離心去除酒精，干燥沉淀后溶解。

該操作的優點在于：操作條件溫和，不易引起生物大分子的變性。同時具有很高的沉淀效能，少量的PEG可以沉淀相當多的生物大分子。