細胞鑒定指南

細胞污染是細胞生物學實驗室中常見的情形。細胞污染通常分為微生物污染和真核生物污染。微生物污染指的是真菌、細菌、支原體等的污染。微生物污染容易辨識，可通過肉眼和利用顯微鏡觀察培養基的顏色變化進行判斷。細菌污染通常使培養基變黃，且顯微鏡下有小黑點，酵母污染的培養基變紫色，顯微鏡下可見透明成串的圓形斑。但支原體污染較難看出，因為支原體的生長較慢，因此很容易被忽略。真核生物污染是由于實驗員操作不當發生的細胞系之間的交叉污染。為避免細胞污染造成深遠的影響，細胞鑒定萬不可少。

細胞系的鑒定主要圍繞四個方面進行：

1、種系來源：常用技術包括STR分型，限制片段長度多態性（AFLP），染色體組分析，同工酶分析，人淋巴細胞抗原（HLA）分型。STR分型是重要的種系來源判斷手段。STR位點，又被稱為微衛星，是3-7 bp的短串聯重復序列，具有高度多態性，被稱為細胞的DNA圖譜指紋，因此可以進行STR分型，通過與專業數據庫比對，判斷樣本所屬細胞系。

2、組織來源：常用技術包括形態學手段、免疫組化分析。形態學手段是利用不同組織可能具有特殊的形態學結構判斷組織來源。免疫組化是利用標記的抗體定位組織特異性抗原來確定細胞的組織來源。

3、特異性功能檢測：根據細胞種類和功能，采用特異性指標鑒定細胞。比如，腺細胞產生分泌蛋白或者激素。腫瘤細胞需要具備腫瘤組織的特性。

4、是否發生轉化和惡變：常用技術包括核型分析、細胞生長行為觀察（是否接觸抑制）、裸鼠成瘤實驗等。核型分析包括對染色體數目、形態、組成的研究，常用到染色體染色技術。核型分析可揭示染色體是否發生畸變、細胞功能、進化活動和分裂關系。長期傳代可能會造成染色體畸變，因此需要定期檢查染色體核型。正常細胞在培養過程中可能會轉化，獲得永生性或者惡型性。因此需要鑒定來區分正常細胞或者腫瘤細胞。

腫瘤細胞鑒定

對于腫瘤細胞，需要鑒定其是否保留腫瘤組織的特性，因此需要進行一些鑒定步驟，包括集落形成實驗、成瘤性檢測和正常組織侵襲實驗等。

a. 細胞集落形成實驗：癌細胞株對培養條件的適應性較強、獨立生存能力也較強，細胞集落率更高。因此可以通過測定細胞集落形成率，判斷細胞的生長能力，從而判定是否為無限細胞系。

b. 成瘤性檢測：將腫瘤細胞注射進入裸鼠體內，檢測是否能在裸鼠體內形成腫瘤。

c. 正常組織侵襲實驗：該實驗是檢測腫瘤細胞是否對正常組織具有侵襲和轉移的能力。

d. 其他：其他還包括對于密度依賴生長特性改變（接觸抑制）、分子水平特征的鑒定。接觸抑制是判定腫瘤和正常細胞的重要依據。

干細胞鑒定

干細胞的重點是檢測細胞的多能性。常規鑒定方法包括核型分析、擬胚體（EB）形成分析、三胚層分化檢測、堿性磷酸酶染色、多能性標志物檢測和畸胎瘤檢測等。

a. EB分化檢測：EBs是人誘導多能干細胞的三維聚集物，即是干細胞多能性的標志。EB分化檢測的流程是：將EB接種于含血清的培養基中自發分化，然后利用流式檢測三胚層表面標志物，判定多能性。

b. 三胚層分化檢測：分別將胚胎干細胞或者誘導多能干細胞向三胚層分化培養，分別檢測特定胚層的標志物，從而判斷其多能性。

c. 堿性磷酸酶（Ap）染色：未分化的干細胞會高水平表達Ap。通過對固定的干細胞染色，分化的細胞無色，未分化的細胞呈現紫色或者紅色。Ap染色是一種低成本、簡單快速的方法。

d. 多能性標志物檢測：未分化狀態的ES和iPS能表達特定的表面標志物，包括TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-3、SSEA-4、Nanog、SOX2、Oct4等。

e. 畸胎瘤檢測：將一定數量的干細胞注射進入免疫缺陷小鼠體內， 4-12周后，多能干細胞能生成畸胎瘤。畸胎瘤包含了三個胚層的組織，可通過組織學手段檢測。但是該方法耗時費力，費用大。