培養(yǎng)基常見問題

一、如何選用培養(yǎng)基?   選擇培養(yǎng)基沒有一定標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考：

1. 建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞第一個(gè)選的培養(yǎng)基。可以查閱文獻(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。

2. 根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選1640；進(jìn)行細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，可選擇IMDM。

3. 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。

4.ATCC（American Type Culture Collection）收集了絕大多數(shù)細(xì)胞的詳細(xì)資料。打開ATCC網(wǎng)頁的Cells and hybridomas鏈接，輸入細(xì)胞名稱就可以搜索ATCC的細(xì)胞數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫中有每一種細(xì)胞的詳細(xì)描述，包括細(xì)胞的來源，培養(yǎng)和凍存條件，以及相關(guān)文獻(xiàn)等資料。

二、液體培養(yǎng)基可以放-20℃保存嗎？

不可以！因?yàn)樵?20℃下，培養(yǎng)基中的鹽容易析出，培養(yǎng)基融化后，有的鹽可能無法重新溶解，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基滲透壓降低，培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞容易破裂而死亡。   

三、新配制的液體培養(yǎng)基能保存多久？

我們建議將新配制的培養(yǎng)基放置于4℃，避光保存盡量在一周內(nèi)使用完畢。培養(yǎng)基越新鮮越好。

四、培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。

五、培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除了特殊篩選系統(tǒng)外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

為防止細(xì)菌、真菌污染，可以加入青霉素-鏈霉素雙抗溶液，其培養(yǎng)基中的終濃度為青霉素100U/ml，鏈霉素為100ug/ml。   

六、為何培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO₂ 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑（通常為phenol red）的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無菌過濾之CO₂， 以調(diào)整pH 值。

七、培養(yǎng)液pH是怎樣影響細(xì)胞生長的？

由于大多數(shù)細(xì)胞適宜PH值為7.2-7.4，偏離此范圍對細(xì)胞將產(chǎn)生有害的影響。各種細(xì)胞對PH值要求也不全部相同，原代細(xì)胞培養(yǎng)一般對PH值變動耐受差，無限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。 但總體來說，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些，偏酸環(huán)境中更有利于細(xì)胞的生長。因此，配制培養(yǎng)用液時(shí)可把液體的PH值稍微調(diào)的偏酸一些。液體在經(jīng)過0.1um或0.2um濾膜過濾時(shí)，PH值會向上浮動0.2左右。

八、為什么液體培養(yǎng)基1640顏色發(fā)黃，是pH值不對嗎？

不是。因?yàn)榕浞皆颍?640為堿酚紅型，其中酚紅的濃度只有DMEM的四分之一，所以是因?yàn)榉蛹t濃度低，而非PH值低。

九、為什么有客戶要求培養(yǎng)基中不含酚紅？

研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，不使用加酚紅的培養(yǎng)基。

十、放置在冰箱中的培養(yǎng)基顏色會發(fā)生變化，為什么？

培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)CO₂會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中酸堿指示劑（通常為phenol red）的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿后再用于細(xì)胞培養(yǎng)將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無菌過濾的CO₂，以調(diào)整pH值。

十一、無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？

當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。因?yàn)檠逯械牡鞍讜Y(jié)合和滅活一些抗生素。而在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活。

十二、培養(yǎng)基各個(gè)成分的作用有哪些？

1.NaHCO₃的作用是什么？

與二氧化碳一起形成緩沖系統(tǒng)，保持培養(yǎng)基PH值穩(wěn)定。

2.丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。丙酮酸鈉的貯存液濃度一般為50mM，-20℃保存，培養(yǎng)基中的終濃度為1mM.

3.加入HEPES有何好處？

培養(yǎng)基中經(jīng)常用的Buffer system是碳酸氫鹽，它可提供營養(yǎng)，但卻在生理PH值條件下會降低緩沖能力。而HEPES是一種很強(qiáng)的Buffer，加入HEPES能使細(xì)胞培養(yǎng)基在PH7.2-7.6條件下緩沖能力增強(qiáng)。HEPES的貯存液濃度一般為1M，常溫保存。培養(yǎng)基中的終濃度為25mM，即5ml 1M的HEPES加入到200ml全部培養(yǎng)基中。

4.酚紅的作用是什么？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。

5.谷氨酰胺的作用是什么？

幾乎所有的細(xì)胞對谷氨酰胺都有較高的要求。谷氨酰胺脫掉氨基后，可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源，參與蛋白質(zhì)的合成和能量代謝。在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長不良而死亡。所以，各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷氨酰胺。

谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置-20℃冰凍保存，用前加入培養(yǎng)基中。加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4度冰箱儲存兩周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。

試驗(yàn)操作中常配制高濃度（100倍）的谷氨酰胺溶液（1ml/支），分裝使用，-20℃保存。使用時(shí)，每支1ml的谷氨酰胺加入到99ml全部培養(yǎng)基中，使其終濃度為2mM培養(yǎng)基。